Eberhard Junkersdorf begann seine Laufbahn in der Filmbranche Anfang der 1960er Jahre als Aufnahmeleiter bei der Rialto Film Preben Philipsen. Neben seiner offiziellen Tätigkeit zählte zu seinen ersten Aktivitäten im Film auch die Darstellung von (ungenannten) Mördern in zwei Beiträgen der populären Edgar-Wallace-Filmreihe: "Das indische Tuch" (1963) von Alfred Vohrer und "Zimmer 13" (1964) von Harald Reinl. Mit beiden Regisseuren hat Junkersdorf später auch bei einigen Karl-May-Filmen zusammengearbeitet.

Mitte der 1960er Jahre ergaben sich erste Arbeitskontakte mit französischen und amerikanischen Firmen und Regisseuren, unter anderem beim Dreh der deutsch-französischen Co-Produktion "Winnetou II" (1964) und dem amerikanischen Spionagethriller "Finale in Berlin" (1966) von Guy Hamilton. Ab 1967 war Junkersdorf dann bei der Independent Film für einige Komödien von Kurt Hoffmann tätig, darunter der dritte "Spessart"-Film mit Liselotte Pulver, "Herrliche Zeiten im Spessart" (1967), sowie "Ein Tag ist schöner als der andere" (1969), bei dem er die Produktionsleitung übernahm.

1970 kam es zu einer für seine weitere Karriere entscheidenden Kooperation: Für Peter Fleischmanns und Volker Schlöndorffs Hallelujah-Film produzierte Junkersdorf "Der plötzliche Reichtum der armen Leute von Kombach", Schlöndorffs Version eines Heimatfilms. Junkersdorf betreute auch die folgenden Filme des Regisseurs und war zudem Co-Produzent von Louis Malles "Lacombe Lucien".

1973 gründete Eberhard Junkersdorf in München mit Volker Schlöndorff und Reinhard Hauff die Bioskop Film GmbH, die eine Reihe der wichtigsten Neuen Deutschen Filme der 1970er und 1980er Jahre herstellte. Neben den Produktionen der Gründungs-Regisseure – wie etwa Schlöndorffs "Die verlorene Ehre der Katharina Blum" (1975) und "Der Fangschuß" (1976) – waren darunter auch die ersten Filme von Herbert Achternbusch, Margarethe von Trotta und Christel Buschmann. Zu den von Junkersdorf betreuten Produktionen zählten dabei Filme wie Achternbuschs "Das Andechser Gefühl", von Trottas "Die bleierne Zeit" (1981) – Gewinner des Goldenen Löwen bei den Filmfestspielen in Venedig – und "Rosa Luxemburg" (1986) sowie Hauffs "Messer im Kopf" (1978) und "Stammheim" (1985), der auf den Internationalen Filmfestspielen in Berlin mit dem Goldenen Bären ausgezeichnet wurde.

Die Bioskop-Film war auch wiederholt deutscher Co-Produzent bei den Filmen, die Volker Schlöndorff in Frankreich und den USA drehte. Höhepunkt dieser Produktionen war – neben zahlreichen Festivalauszeichnungen und Deutschen Filmpreisen – die Oscar-Auszeichnung für Schlöndorffs Grass-Verfilmung "Die Bleichtrommel" (1979).

Mitte der 1990er Jahre wendete sich Junkersdorf dem Animationsfilm zu und gründete 1995 das Zeichentrick-Studio Munich Animation. Beim abendfüllenden Animationsfilm "Die furchtlosen Vier" (1997), einer Adaptation des Grimmschen Märchens von den Bremer Stadtmusikanten, führte er auch erstmals Regie. Der Film wurde mit einem Bayerischen Filmpreis ausgezeichnet. In deutsch-belgischer Koproduktion entstand unter Junkersdorfs Regie auch eine Animations-Version der Geschichten vom "Till Eulenspiegel", die 2003 für einen Animations-Oscar nominiert wurde.

2002 gründete er die Neue Bioskop Germany (NBG1), mit Dietmar Güntsche als Partner, und produzierte für diese unter anderem Oskar Roehlers Berlinale-Wettbewerbsbeitrag "Der alte Affe Angst" (2003) und die Uschi-Obermaier-Filmbiografie "Das Wilde Leben" (2005-2007) von Achim Bornhak.

Junkersdorf ist in verschiedenen Verbänden und Institutionen der Filmwirtschaft aktiv. Er war Ehrenvorsitzender der Arbeitsgemeinschaft Neuer Deutscher Spielfilmproduzenten und von 1997 bis 2014 Vorsitzender des Verwaltungsrates und des Präsidiums der Filmförderungsanstalt (FFA) Berlin, deren Ehrenpräsident er heute ist. Von Februar 2008 bis März 2015 war er Kuratoriumsvorsitzender bei der Friedrich-Wilhelm-Murnau-Stiftung Wiesbaden.

Junkersdorf erhielt 2001 das Bundesverdienstkreuz 1. Klasse und 2004 den Bayerischen Verdienstorden.