Herbert Knaup, geboren am 23. März 1956 in Sonthofen in Bayern, ging nach der Mittleren Reife mit seiner damaligen Freundin Ellen von Unwerth, der später international bekannten Modefotografin, nach München und begann eine Schauspielausbildung an der Otto-Falckenberg-Schule. Ab 1978 folgten Engagements an Theatern in Heidelberg, Zürich, Basel und Wien.

Beim Film debütierte Knaup 1979 in Michael Zens' Hochschul-Abschlussfilm "Coda", gefolgt von "Jaipur Junction" von Werner Schaefer. Seine erste Fernsehrolle spielte er im Tatort "Heißer Schnee" (1984). In Christian Wagners Kinofilm "Wallers letzter Gang" (1988) fiel er als junges Alter Ego des Streckengehers Waller auf. Nachdem Knaup sich zwischenzeitig wieder ganz auf das Theater konzentriert hatte, wurde der an der Kasse floppende Dominik-Graf-Thriller "Die Sieger" 1994 für ihn zum Durchbruch beim Film. Für sein vielschichtiges Spiel als Leiter des Einsatzkommandos erhielt er den Bayerischen Filmpreis und eine Nominierung für den Deutschen Filmpreis.

Nach Sherry Hormanns leichter Komödie "Irren ist männlich" (1996) parodierte Knaup in der Komödie "Die Musterknaben" als korrupter Polizist seine "Sieger"-Rolle. Weitere Komödien folgten, doch besonders in ernsten Filmen fielen Knaups Leistungen auf, etwa als zynischer Kriegsfotograf im Dokudrama "Warshots - Kriegsbilder" (1996) oder als alternder, melancholischer Goethe in "Die Braut" (1998). Auch im Ausland war Knaup erfolgreich, zum Beispiel in der irischen Produktion "Ordinary Decent Criminal" mit Kevin Spacey oder in der amerikanisch-kanadischen TV-Produktion "Nuremberg" über die Nürnberger Prozesse, in der er Albert Speer spielte (beide 2000).

Herbert Knaup vermag es, auch kleinere und kleinste Rollen enorm einprägsam zu gestalten, ob als cholerischer Vater in Tom Tykwers "Lola rennt" (1998, Deutscher Filmpreis als Bester Nebendarsteller), als koksender Intellektueller in Oskar Roehlers "Der alte Affe Angst" (2003) oder als Spiegel-Redakteur in Florian Henckel von Donnersmarcks Oscar-Gewinner "Das Leben der Anderen" (2006). In Roehlers grellem Familienmelodram "Agnes und seine Brüder" (2004) spielte Knaup den Grünen-Politiker, der schließlich mit der Motorsäge Amok läuft. Eine weitere herausragende Darstellung lieferte er als Regierungssprecher in der TV-Serie "Kanzleramt" (2005).

2005 wurde Knaup mit der Goldenen Kamera als Bester deutscher Schauspieler geehrt, für den Deutschen Filmpreis 2008 erhielt für die Beste Nebenrolle in Bernd Böhlichs "Du bist nicht allein" eine weitere Nominierung.

In den Jahren danach wirkte er in hochkarätigen Fernsehspielen wie Markus Rosenmüllers Thriller "Augenzeugin" (2008), Roland Suso Richters "Mogadischu" (2008) oder, in der Titelrolle, im Dokudrama "Eichmanns Ende" (2010) mit. Prägnante Kinoauftritte hatte er als Erzengel Michael in "Die Geschichte vom Brandner Kaspar" (2008), in Matthias Glasners umstrittenem Drama "This Is Love" (2009), als mysteriöser "Mr. High" in der Groschenroman-Verfilmung "Jerry Cotton" (2010) oder als lässiger Restaurantbesitzer in der Beziehungskomödie "Bon Appetit" (2010). Im gleichen Jahr stand er an der Seite von Benno Fürmann und Maria Schrader für das Kriegsdrama "In Darkness" vor der Kamera, das im Februar 2012 in die Kinos kam. Bereits 2011 startete die Tragikomödie "Arschkalt", in der Knaup einen ehemaligen Manager gab, der inzwischen als Tiefkühlkost-Ausfahrer arbeitet.

Danach sah man Knaup vor allem in Fernsehproduktionen: In der Udo-Jürgens-Filmbiografie "Der Mann mit dem Fagott" (2011) verkörperte er den Onkel des Sängers; in der Komödie "Pilgerfahrt nach Padua" (2011) spielte er einen grantigen Busfahrer, und in "Komm, schöner Tod" (2012) einen Journalisten, der sich für die Legalisierung von Sterbehilfe einsetzt. 2012 schlüpfte er in der Bestsellerverfilmung "Milchgeld. Ein Kluftingerkrimi" erneut in der Rolle des Allgäuer Kommissars Kluftinger, den er bereits 2009 in "Erntedank" gespielt hatte und den er 2013 beziehungsweise 2016 drei weitere Male verkörperte, in "Seegrund", "Schutzpatron" und "Herzblut".

Auf der Kinoleinwand hingegen machte Knaup sich eher rar: In Til Schweigers "Schutzengel" (2012) gab er einen undurchschaubaren Polizeichef, in Dietrich Brüggemanns "Drei Zimmer/Küche/Bad" (2012) den Vater einer ewigen WG-Bewohnerin. Eine größere Kinorolle hatte er als Uhrmachermeister Zifferle in der Otfried-Preußer-Verfilmung "Das kleine Gespenst", die im Herbst 2013 in die Kinos kam.

Abgesehen von einer Nebenrolle in der Kinokomödie "Irre sind männlich" (2014, Regie: Anno Saul) und einer Sprechrolle als Erzähler bei dem Roadmovie "Die letzte Sau" (2016, Regie: Aron Lehmann), sah man Knaup in den nächsten Jahren ausschließlich in TV-Produktionen. Zu seinen wichtigsten Rollen gehörten ein Fußball-Funktionär in "Landauer – Der Präsident" (DE/AT 2014, Regie: Hans Steinbichler), ein opportunistischer Politiker in dem preisgekrönten, politisch hochbrisanten Waffenindustrie-Drama "Meister des Todes" (2015, Regie: Daniel Harrich) und der kleinstädtische Vater eines rechtsextremen Terroristen in Stephan Lacants "Toter Winkel" (2017). Für letztere Rolle wurde Knaup mit dem Günter-Rohrbach-Filmpreis ausgezeichnet. Außerdem erhielt für diese Rolle und für seine Verkörperung des mächtigen Kaufmanns Jakob Fugger in den Historiendrama "Die Puppenspieler" (2017) eine Nominierung für den Bayerischen Filmpreis. Der Regisseur Dominik Graf besetzte Knaup in seinem Fernsehspiel "Hanne" (2018) als Studentenliebe der Titelfigur (Iris Berben).

Acht Jahre lebte Herbert Knaup mit Natalia Wörner zusammen, die er bei "Die Sieger" kennenlernte. Seit 2006 ist er mit der Musikproduzentin Christiane Lehrmann verheiratet.