Juliane Köhler, geboren am 6. August 1965 in Göttingen als Tochter von Marionettenspielern, besuchte zunächst das Schauspielstudio Gmelin in München und ging 1985 nach New York, wo sie bis 1988 Schauspiel bei Uta Hagen studierte. Ihr Bühnendebüt gab sie 1988 am Staatstheater Hannover, wo ihr ein festes Engagement angeboten wurde. Nach fünf Jahren wechselte sie nach München ans Bayerische Staatsschauspiel und schließlich ans Residenztheater. Zu Bühnenruhm kam sie unter anderem durch ihre Titelrolle in Arthur Schnitzlers "Fräulein Else".

1997 kam es zu einer Vertragslösung im Streit, als Köhlers Bühnenzeitplan am Residenztheater mit den Verpflichtungen für den Kinofilm "Aimée & Jaguar" (1998) kollidierte, für den sie von dem ehemaligen Theatermann Max Färberböck engagiert worden war. Allerdings sollte sich der Eklat für Juliane Köhler lohnen: Ihre Verkörperung einer homosexuellen Frau während des Dritten Reichs brachte ihr einen Silbernen Berlinale-Bär (zusammen mit Maria Schrader) und den Deutschen Filmpreis ein. Praktisch über Nacht avancierte Köhler zu einer der vielversprechendsten Darstellerinnen des deutschen Kinos – ein Image, das sich mit den eindrucksvollen Rollen in Caroline Links "Nirgendwo in Afrika" (2002) und Oliver Hirschbiegels "Der Untergang" (2004, als Eva Braun) weiter festigte.

Spielte sie in der Regel starke Charaktere, die sich durch Kraft und Eigensinnigkeit auszeichnen, so verkörperte Köhler in Sylke Enders' "Mondkalb" (2008) eine überaus unsichere, zurückgezogen lebende Frau – und stellte damit einmal mehr ihre darstellerische Vielseitigkeit unter Beweis.

Nach Nebenrollen in zwei Filmen, die während oder kurz nach dem 2. Weltkrieg spielen, "Ein Leben für ein Leben – Adam Resurrected" (2008) und "Anonyma – Eine Frau in Berlin" (2008), überzeugte sie 2009 als Mutter Luise von Briest in Hermine Huntgeburths Fontane-Adaption "Effi Briest". In diesem Jahr bekam Juliane Köhler auch den Bayerischen Verdienstorden überreicht. 2011 sah man Juliane Köhler in dem Kinofilm "Das Blaue vom Himmel", in dem sie als Tochter einer zusehends an Demenz leidenden Frau ein lange gehütetes Familiengeheimnis aufdeckt. Im Fernsehen gehörte sie seit 2010 unter anderem zum Ensemble der hoch gelobten und preisgekrönten Mini-Serie "Klimawechsel" (Regie: Vanessa Jopp), nach einer Idee von Doris Dörrie. Auch im TV-Märchenfilm "Sterntaler" (2011) und im Kölner "Tatort" war Köhler in der Folgezeit zu sehen.

Daneben wirkte Köhler auch in internationalen Produktionen mit, so etwa in Costa Gavras' Migrantendrama "Eden à l'Ouest" (F/G/I, 2009) oder, in einer Hauptrolle, in der deutsch-italienischen Koproduktion "Ein ruhiges Leben", einem Familien- und Mafiadrama mit Toni Servillo, das im Mai 2012 in den deutschen Kinos startete. Ebenfalls 2012 war Juliane Köhler am Kurzfilm "Karlstod" beteiligt, außerdem las die nebenberufliche Hörspielsprecherin im Dokumentarfilm "Alexander Granach – Da geht ein Mensch" aus der Autobiografie des Berliner Schauspielers der 1920er Jahre. Zudem wurde Köhler im gleichen Jahr die Europamedaille des Freistaates Bayern verliehen.

Große Aufmerksamkeit wurde Juliane Köhler dann in Georg Maas' deutsch-norwegischer Koproduktion "Zwei Leben" (2013) zuteil: Im deutschen Oscarbeitrag 2014 spielte sie an der Seite der ikonischen Bergman-Schauspielerin Liv Ullmann eine Frau mit einer komplexen Vergangenheit. Köhlers überzeugendes Portrait der ambivalenten Protagonistin Katrine, einer Familienmutter mit Stasi-Geschichte, hinter der wiederum eine Verbindung zum Lebensborn-Projekt der Nationalsozialisten steht, brachte der Schauspielerin eine Nominierung für den Deutschen Filmpreis 2014 ein.

Nach "Zwei Leben" übernahm Köhler zuletzt eine Nebenrolle in der Doris-Dörrie-Komödie "alles inklusive" (2014). Eine weitere Kinorolle hatte sie in Sönke Wortmanns Charlotte-Roche-Verfilmung "Schoßgebete" (2014), als Therapeutin des im Mittelpunkt stehenden Pärchens. In dem viel gelobten Fernsehspiel "Für eine Nacht… und immer?" (2015) sah man sie in der Hauptrolle einer Mittvierzigerin, die sich in einen 20 Jahre jüngeren Mann verliebt. Außerdem spielte Köhler in den Kölner "Tatort"-Folgen weiterhin die Polizeipsychologin Lydia Rosenberg.

Nach einer kleinen Rolle in dem norwegischen Weltkriegsdrama "Kongens nei" ("The King's Choice - Angriff auf Norwegen", 2016) sah man Köhler wieder in einer Hauptrolle auf der Kinoleinwand: Bei den Hofer Filmtagen 2016 wurde die Tragikomödie "Der Hund begraben" aufgeführt, in der sie die Ehefrau eines Mannes spielt, dessen Leben nach seinem Jobverlust zusehends aus den Fugen gerät. Bei der Berlinale 2017 lief in der Sektion Perspektive Deutsches Kino die Mutter-Töchter-Geschichte "Back for Good"; darin verkörperte Köhler die fürsorgliche Mutter zweier problembelasteter Töchter. Kurz darauf, im März 2017, startete "Der Hund begraben" regulär in den Kinos.

Nebenrollen hatte Köhler in der Liebesgeschichte "Auf der anderen Seite ist das Gras viel grüner" (2017) und in dem Roadmovie "Vielmachglas" (2018). Außerdem spielte sie weiterhin in den Kölner-"Tatort"-Folgen des Teams Ballauf und Schenk die Polizeipsychologin Lydia Rosenberg. Im Mai 2018 hatte schließlich auch "Back for Good" seinen offiziellen Kinostart, gefolgt im August von Rudi Gauls Komödie "Safari - Match me if you can".

Weitere Kinorollen spielte sie in der deutsch-israelischen Romantik- und Culture-Clash-Komödie "Kiss Me Kosher" (2020) als Mutter der deutschen Hauptfigur, und im Ensemble von Bruno Dumonts Drama "France" (FR/IT/DE/BE 2021).  

Im Fernsehen sah man Köhler, neben ihrer festen "Tatort"-Rolle, ab 2019 in einer Hauptrolle als Oberhebamme in der neuen Dramedy-Fernsehspielreihe "Toni, männlich, Hebamme". Daneben wirkte sie in TV-Produktionen wie dem Ensemble-Drama "Eine harte Tour" (2020) mit.  

2024 hatte Köhler eine Hauptrolle in dem sechsteiligen Familiendrama "Haus aus Glas" und, ebenfalls als Mutter einer dysfunktionalen Familie, in dem Kinofilm "Sonnenplätze".