Axel Eugen Alexander von Oesterreich wurde am 22. Juni 1910 in Hamburg geboren. Auf Anraten seines Vaters, eines aus dem russischen St. Petersburg eingewanderten, deutschstämmigen Kaufmanns, änderte er schon in jungen Jahren seinen Namen in "Axel von Ambesser" um, so der Gedanke des Vaters, bei alphabetischer Reihenfolge frühzeitig genannt zu werden. Obwohl er über keinerlei schauspielerische Ausbildung verfügte, vermittelte der Intendant Erich Ziegel dem theaterbegeisterten Ambesser ab 1930 einzelne Rollen an den Hamburger Kammerspielen. Es folgten Engagements am Stadttheater Augsburg und den Münchner Kammerspielen, wo er vor allem in Rollen als jugendlicher Held, galanter Liebhaber und Charakterkomiker zu sehen war. 1936 stand er am Deutschen Theater in Berlin auf der Bühne, bis 1945 folgten Auftritte und Engagements am Wiener Theater in der Josefstadt und dem Berliner Staatstheater (unter Gustaf Gründgens).

Sein Debüt als Filmschauspieler gab Axel von Ambesser 1935 mit einer kleinen Rolle in Carl Boeses "Der Gefangene des Königs". Wenngleich sein Arbeitsschwerpunkt weiterhin auf der Theaterarbeit lag, wirkte er in den kommenden Jahren regelmäßig auch in Kinofilmen mit, zumeist in tragenden Nebenrollen: so etwa als "Verehrer" in Erich Engels Liebeskomödie "Ein hoffnungsloser Fall" (1939), als Prinz an der Seite von Zarah Leander in Carl Froelichs "Das Herz der Königin" (1940) oder, in einer Hauptrolle, als Bürger mit dem vielsagenden Namen Biedermann in Wolfgang Staudtes Bürokratie-Satire "Der Mann dem man den Namen stahl" (1945), der allerdings von der Nazi-Zensur zurückgehalten wurde.

Nach dem Ende des Zweiten Weltkriegs erhielt Ambesser unter Erich Engel und später Hans Schweikart Engagements an den Münchner Kammerspielen, bevor er ab Ende der 1940er Jahre als freischaffender Schauspieler tätig war. Zunehmend arbeitete er nun auch als Autor für Bühne, Film und Fernsehen sowie das Münchner Nachkriegskabarett "Die Schaubude". Bei einigen seiner Stücke übernahm er selbst die Regie und spielte die Hauptrolle. Mit Erfolgsstücken wie "Das Abgründige in Herrn Gerstenberg", "Wie führe ich eine Ehe?" oder "Omelette Surprise" avancierte Ambesser noch vor Carl Zuckmayer und Bertolt Brecht vor allem in den Nachkriegsjahren zum meistgespielten lebenden deutschsprachigen Autor.

1953 gab Axel von Ambesser mit der Komödie "Glück muß man haben" (in Deutschland unter dem Titel "Drei, von denen man spricht" bekannt) sein Debüt als Filmregisseur. Bis Mitte der 1960er Jahre inszenierte er insgesamt 19 Kinofilme. Zu seinen bekanntesten und erfolgreichsten Regiearbeiten gehören die Heinz-Rühmann-Komödie "Der Pauker" (1958), die Gaunerkomödie "Der Gauner und der liebe Gott" (1960) mit Gert Fröbe und Karlheinz Böhm und "Der brave Soldat Schwejk" (1960), in dem ebenfalls Heinz Rühmann die Hauptrolle spielt, und der mit einem Golden Globe als bester ausländischer Film ausgezeichnet wurde. Auch der Heimatfilm "Kohlhiesels Töchter" (1962) mit Liselotte Pulver und der Pater-Brown-Krimi "Er kann’s nicht lassen" (1962) wurden große Publikumserfolge.

Auch als Schauspieler trat Axel von Ambesser während dieser Jahre gelegentlich vor die Kamera, etwa in Nebenrollen seiner eigenen Regiearbeiten oder in Filmen wie Rolf Hansens "Gustav Adolfs Page" (1960). Für den Klassiker "Monsieur Verdoux" schrieb er die deutsche Dialogfassung und übernahm die Synchronisation von Charlie Chaplin.

Ab Mitte der sechziger Jahre arbeitete Ambesser als Regisseur und Schauspieler nur noch fürs Fernsehen. Hier inszenierte er musikalische Komödien wie "Der fidele Bauer" (1971) oder gediegene Liebesgeschichten wie "Begegnung im Herbst" (1977) mit Hilde Krahl und Ambesser selbst in den Hauptrollen. 1975 wurde er mit dem Bundesverdienstkreuz ausgezeichnet.

Anfang der 1980er Jahre zog Axel von Ambesser sich weitgehend von der Fernseh-, nicht aber von der Theaterarbeit zurück. 1985 veröffentlichte er unter dem Titel "Nimm einen Namen mit A" seine Autobiografie. Im gleichen Jahr erhielt er das Filmband in Gold für "langjähriges und hervorragendes Wirken im deutschen Film" sowie das Große Bundesverdienstkreuz. Zwei Jahre später erschien Ambessers Roman "Aber fragt mich nur nicht wie…". Für eine Folge der TV-Serie "Die Schwarzwaldklinik" ("Der alte Herr") sowie für das österreichische Fernsehspiel "Der Vorhang fällt" trat Axel von Ambesser, der bis zuletzt am Theater aktiv war, 1988 ein letztes Mal vor die Kamera. Am 6. September 1988 starb er in München.

Seit 1937 war Axel von Ambesser mit der Schauspielerin Inge von Ambesser verheiratet, die 1995 verstarb. Gwendolyn von Ambesser, die Tochter des Paares, ist als Regisseurin, Autorin und Schauspielerin tätig.