Rosa von Praunheim wurde am 25. November 1942 in Riga zur Zeit der deutschen Besatzung unter dem bürgerlichen Namen Holger Radtke geboren und wuchs bei Adoptiveltern in Berlin (Ost) unter dem Namen Holger Bernhard Bruno Mischwitzky auf. Nach der Flucht in den Westen im Jahr 1953 lebte die Familie zunächst im Rheinland und ließ sich schließlich in Frankfurt am Main nieder. Hier besuchte von Praunheim ein Humanistisches Gymnasium, das er allerdings schon nach Abschluss der Mittleren Reife verließ. Er nahm ein Studium im Fachbereich "Freie Malerei" an der Offenbacher Werkkunstschule (heute: Hochschule für Gestaltung – HfG) auf, wechselte nach einem Jahr an die Hochschule für Bildende Künste in Berlin. Beide Studiengänge beendete er ohne Abschluss. Zu dieser Zeit, Mitte der 1960er-Jahre, nahm er seinen Künstlernamen an, den er als Reminiszenz an sein Frankfurter Viertel Praunheim und an den "Rosa Winkel" verstand – das Symbol, mit dem während des Dritten Reichs Homosexuelle in Konzentrationslagern gekennzeichnet wurden.

Im Jahr 1967 gab Rosa von Praunheim sein Filmdebüt mit dem Kurzfilm "Von Rosa von Praunheim", den er an den Hessischen Rundfunk verkaufen und somit weitere Filmprojekte finanzieren konnte. Bis Ende der 1960er-Jahre dreht er Kurz- und Experimentalfilme wie "Grotesk – Burlesk, Pittoresk" (1968), "Schwestern der Revolution" (1969) und "Samuel Beckett" (1969). Sein Langfilmdebüt, die mit absoluten Laiendarstellern und praktisch ohne Budget gedrehte Beziehungsgeschichte "Die Bettwurst" (1970) avancierte binnen kurzer Zeit zu einem Kultfilm. Im selben Jahr erregte er mit dem Film "Nicht der Homosexuelle ist pervers, sondern die Situation, in der er lebt" großes Aufsehen weit über die Schwulenszene hinaus – praktisch über Nacht stieg von Praunheim zu einer Ikone der deutschen Schwulenbewegung auf, die durch seinen Film einen regelrechten Aufschwung erlebte.

In den kommenden Jahren wurden Rosa von Praunheims Spiel- und Dokumentarfilme von drei thematischen Bereichen geprägt: die Lebenswege vitaler, älterer Frauen (etwa in "Unsere Leichen leben noch", 1981), Homosexualität und Aids ("Ein Virus kennt keine Moral", 1985) und die Stadt New York ("Überleben in New York", 1989). 1991 sorgte er mit seiner "Outing"-Kampagne für einen Skandal: In der medienwirksamen Aktion "outete" von Praunheim Prominente, die ihre Homosexualität geheim hielten. Mit der moralisch fragwürdigen Aktion wollte er nach eigener Aussage auf die vernachlässigte Aids-Problematik sowie bürgerliche Doppelmoral aufmerksam machen.

Neben skurrilen, postmodern anmutenden Spielfilmen wie "Der Einstein des Sex" (1999) wendete von Praunheim sich seit den 1990er-Jahren in erster Linie (semi-)dokumentarischen Pojekten zu. Vorwiegendes Thema waren auch hier die verschiedenen Facetten homosexuellen Lebens, von "Ich bin meine eigene Frau" (1992) über die Geschichte der deutschen Transvestiten-Bewegung im 20. Jahrhundert, über "Männer, Helden, schwule Nazis" (2005) über homosexuelle Rechtsradikale bis hin zu "Tote Schwule – lebende Lesben" (2008), in dem er die Vision einer von Frauen regierten Subkultur und damit eine Geschichte der Homosexualität und ihrer Unterdrückung entwarf, die er neu gewichtete.

Erst im Jahr 2000 erfuhr von Praunheim, dass er ein Adoptivkind war. Nach dem Tod seiner Ziehmutter begann er im Jahr 2003 mit einer intensiven Recherche über seine Herkunft, die er in dem überaus persönlichen Film "Meine Mütter – Spurensuche in Riga" (2007) dokumentierte.

In den folgenden Jahren realisierte Praunheim weitere Dokumentarfilme, die sich zumeist auf unterschiedliche Weise mit dem Themenkomplex Homosexualität beschäftigten, so etwa "Rosas Höllenfahrt" (2009), eine Geschichte der "Hölle" aus schwuler Perspektive, oder "Die Jungs vom Bahnhof Zoo" (2011), der einen klischee- und vorurteilsfreien Blick auf das Leben von fünf jungen Berliner Strichern warf.

Wie viele seiner Filme feierte 2012 auch "König des Comics" im Panorama der Berlinale Premiere. Darin porträtierte von Praunheim den schwulen Comic-Künstler Ralf König ("Der bewegte Mann").

Zu von Praunheims siebzigstem Geburtstag strahlte der Fernsehsender RBB in Zusammenarbeit mit Arte unter dem Titel "Rosas Welt" in der Nacht vom 24. auf den 25. November 2012 eine Kurzfilmreihe des Filmemachers aus, die eine Gesamtlänge von 700 Minuten hatte – ein Novum, denn nie zuvor wurde einem einzelnen Dokumentarfilmer im deutschen Fernsehen soviel Sendezeit am Stück zur Verfügung gestellt. Die Reihe der meist 20-minütigen Filme bestand aus Portraits, etwa über Eva Mattes und Werner Schroeter, aber auch über nicht prominente Menschen und Familien.

Auch in den folgenden Jahren blieb Rosa von Praunheim ein unermüdlicher Filmemacher: Bei den Lichter Filmtagen Frankfurt 2014 feierte sein Dokumentarfilm "Praunheim Memoires" Premiere, in dem er sich auf eine Spurenssuche zu den Stationen seines eigenen Lebens begab. In "Auf der Suche nach Heilern", der beim DOK.fest München 2014 uraufgeführt wurde, dokumentierte er seine persönlichen Erfahrungen mit Wunderheilern aller Art. Im Dezember 2014 startete "Laura - Das Juwel von Stuttgart" in ausgewählten Kinos, ein Dokumentarfilm über die sozial engagierte Betreiberin eines der ältesten Schwulenclubs Deutschlands.

Im Panorama der Berlinale 2015 stellte Rosa von Praunheim "Härte" vor, einen dokumentarischen Spielfilm über das Leben des ehemaligen Karate-Champions und einstigen Zuhälters Andreas Marquardt, der als Kind vom Vater schwer misshandelt und von der Mutter sexuell missbraucht wurde. Im April 2015 startete der Film in den deutschen Kinos. Ebenfalls 2015 wurde Rosa von Praunheim mit dem Bundesverdienstkreuz geehrt.

Bei den Hofer Filmtagen 2015 stellte er den Kurz-Dokumentarfilm "Flüchtlinge, zu viel?" vor, in dem zwei Bürger mit Migrationshintergrund ihre unterschiedlichen Meinungen in der Flüchtlingsfrage darlegten. Auf der Berlinale 2016 zeigte von Praunheim "Welcome All Sexes: 30 Jahre Teddy Awards" (2016), eine Dokumentation über die Geschichte des schwul-lesbischen Filmpreises der Panorama-Sektion.

Gut ein Jahr später, im April 2017, wurde beim Achtung Berlin Festival "ACT! - Wer bin ich?" uraufgeführt, ein Dokumentarfilm über die pädagogische Theaterarbeit des Berliner Vereins ACT, der mit Problemschülern Bühnenstücke inszeniert. Der Film erhielt den New Berlin Film Award und startete im Juni 2017 regulär in den Kinos. Im gleichen Monat feierte beim Münchner Filmfest bereits von Praunheims nächster Dokumentarfilm Premiere, "Überleben in Neukölln" (2017), in dem das Leben und der Alltag im Berliner "Problembezirk" Neukölln unter verschiedenen Gesichtspunkten beleuchtet wird.

Ebenfalls 2017 gratulierte Bundespräsidenten Frank-Walter Steinmeier Rosa von Praunheim in Form einer öffentlichen Danksagung zum 75. Geburtstag. Im gleichen Jahr erschien sein autobiografisches Lehrbuch "Wie wird man reich und berühmt?".

"Männerfreundschaften" (2018), ein Dokumentarfilm mit Spielfilmszenen über die Sexualität Johann Wolfgang von Goethes, wurde beim Lichter Filmfest Frankfurt als Bester Langfilm ausgezeichnet. 2019 erhielt von Praunheim bei dem bedeutenden schwullesbischen Pink Apple Festival in Zürich einen Preis für sein Lebenswerk. Im Januar 2020 würdigte auch das Filmfestival Max Ophüls Preis ihn mit einem Ehrenpreis. Kurz darauf startete sein nächster Spielfilm in den Kinos: "Darkroom" (2019), nach dem realen Fall eines Krankenpflegers, der in Schwulenclubs mit anderen Männern anbandelte und sie mit einer Überdosis k.o.-Tropfen tötete und ausraubte.

Im Herbst 2022 kam "Rex Gildo – Sein letzter Tanz" in die deutschen Kinos. Mithilfe einer Kombination aus Archivmaterial und Spielszenen zeichnet von Praunheim darin ein Porträt des Schlagerstars und Frauenschwarms Rex Gildo, der seine Homosexualität in den repressiven 1950er und 1960er Jahren nur heimlich ausleben konnte.

Anlässlich seines 80. Geburtstags wurde Rosa von Praunheim mit einer öffentlichen Danksagung des Beauftragten der Bundesregierung für die Akzeptanz sexueller und geschlechtlicher Vielfalt Sven Lehmann geehrt. Er blieb weiterhin sehr produktiv. Bei den Hofer Filmtagen 2024 feierte "30 Jahre an der Peitsche" Premiere – ein Dokumentarfilm über eine Domina, die im selben Mietshaus lebt und arbeitet wie der Regisseur. In der Sektion Panorama der Berlinale 2025 präsentierte von Praunheim anschließend "Satanische Sau" – ein Dokumentarfilm mit Spielfilmszenen als Rückschau auf sein Leben, mit dem Schauspieler Armin Dallapiccolla als seinem Alter Ego. Der Film erhielt den Teddy Award als Bester Dokumentar-/Essayfilm und kam im November 2025 in die Kinos.

Neben seiner Tätigkeit als Filmemacher arbeitete Rosa von Praunheim seit den 1960er-Jahren zudem als Sachbuchautor, Dichter und Schriftsteller. Ab Mitte der 1970er-Jahre trat er auch immer wieder als Theater- und Musicalregisseur in Erscheinung und inszenierte auch eigene Werke. Für seine politische Farce "Hitlers Ziege und die Hämorrhoiden des Königs" am Deutschen Theater in Berlin wurde er mit dem Jury-Preis der Autorentheatertage 2019 ausgezeichnet. Für die Liedtexte seines Musicals "Die Bettwurst", basierend auf seinem gleichnamigen Kultfilm, erhielt von Praunheim 2023 eine Nominierung für den Deutschen Musical Theater Preis. Ebenfalls 2023 erschien das Taschenbuch "Rosas Theater", mit seinen vier bis dahin entstandenen Theaterstücken. Aus diesem Anlass zeigte das Kino des DFF - Deutsches Filminstitut & Filmmuseum, Frankfurt, den 90-minütigen Film "Rosas Theater" mit Videoausschnitten von Inszenierungen der vier Stücke.

Bis 2006 war Rosa von Praunheim außerdem als Dozent für Filmregie an der Hochschule für Fernsehen und Film in Potsdam tätig. 

Ende September 2025 schloss Rosa von Praunheim die Dreharbeiten zu seinem letzten Film "Sex und Tod" ab – eine Aufführung erlebte er nicht mehr. Er starb am 17. Dezember 2025 im Alter von 83 Jahren in Berlin. Nur wenige Tage zuvor hatte er seinen langjährigen Lebensgefährten Oliver Sechting geheiratet.