Liesl Karlstadt, geboren am 12. Dezember 1892 in München als Elisabeth Wellano, war das fünfte von neun Kindern eines Münchner Bäckers. Nach einer Lehre als Verkäuferin war sie zunächst in diesem Beruf tätig, engagierte sich parallel jedoch als Musikerin – wie ihr späterer Partner Karl Valentin beherrschte sie eine ganze Reihe von Instrumenten. Bereits mit 17 Jahren versuchte sie sich als Volkssängerin und wurde mit 20 als Sängerin und Tänzerin in die Singspieltruppe von Adalbert Meier aufgenommen. Als Schauspielerin stand sie in Stücken wie "Kabale und Liebe" und "Die Kameliendame" auf der Bühne.

Im Jahr 1911 traf Karlstadt im "Frankfurter Hof" auf Karl Valentin – der Beginn einer überaus fruchtbaren und erfolgreichen Zusammenarbeit: Das Duo Valentin/Karlstadt zählt zu den berühmtesten und wegweisendsten Komikerpaaren des 20. Jahrhunderts, deren Namen bis heute untrennbar miteinander verbunden sind. In den über 25 Jahren ihrer gemeinsam Auftritte kamen sie auf rund 400 Sketche, von denen eine große Zahl aus Liesl Karlstadts Feder stammte. Neben ihren Bühnenerfolgen gehörten Valentin und Karlstadt auch zu den Pionieren des Kinos. Bereits 1912 begannen sie, mit dem neuen Medium zu experimentieren.

Nach zahlreichen komödiantischen Stummfilmen in den 1920er Jahren beschloss Karlstadt im Jahr 1930, professionellen Schauspielunterricht zu nehmen. Aber trotz eines gelobten Theaterauftritts in dem Stück "Sturm im Wasserglas" fußte ihr Ruhm weiterhin auf der Zusammenarbeit mit Valentin, aus dessen übermächtigem Schatten sie sich nie ganz lösen konnte. Privat war das Verhältnis der beiden indes nicht immer so amüsant, wie es bei ihren Auftritten scheinen mochte. Nachdem der eigenwillige Valentin durch eine Fehlinvestition Karlstadts gesamtes Vermögen verloren hatte, unternahm sie einen Selbstmordversuch. Nach ihrer Genesung folgte eine Reihe erfolgreicher Filme wie "Der Bittsteller" und "Beim Rechtsanwalt" (beide 1936) – abermals an der Seite von Karl Valentin.

Karlstadts Popularität hielt auch nach Valentins Tod im Jahr 1948 an, wobei sie in den folgenden Jahren am Münchner Residenztheater und den Kammerspielen vermehrt in ernsteren Rollen Erfolge feierte. Beim Bayerischen Rundfunk bekam sie mit "Familie Brandl" eine eigene Sendung. Im Kino war sie allerdings vorwiegend in Nebenrollen zu sehen. Zu ihren bekanntesten Filmen dieser Zeit gehören "Fanfaren der Ehe" (1953), "Die Trapp-Familie" (1956) und die Satire "Wir Wunderkinder" (1958).

Am 27. Juli 1960 starb Liesl Karlstadt in Garmisch-Partenkirchen an einem Gehirnschlag. In München ist ihr und Karl Valentin das "Valentin Karlstadt Museum" gewidmet.