Karline Eichorn wurde am 9. November 1965 in Stuttgart geboren. Nach dem Abschluss eines Fachabiturs begann sie 1986 eine Ausbildung an der Folkwang-Schauspielschule in Essen. Direkt im Anschluss erhielt sie 1989 ihr erstes Theaterengagement an der Berliner Schaubühne, nachdem sie dort bei Peter Stein in einer Inszenierung von Tschechows "Der Kirschgarten" ihr Bühnendebüt gegeben hatte. Nach fünf weiteren, erfolgreichen Jahren am Schauspielhaus Bochum und (erneut) der Schaubühne gelang ihr 1995 der Fernsehdurchbruch in Nico Hofmanns preisgekröntem Thriller "Der Sandmann" an der Seite von Götz George.

In den kommenden Jahren war Eichhorn vor allem in zahlreichen Fernsehproduktionen zu sehen. Für ihre Verkörperung einer geheimnisvollen Flüchtlingsfrau in dem Nachkriegs-Drama "Gegen Ende der Nacht" (1998) wurde sie 1999 mit dem Grimme-Preis sowie dem Bayerischen Fernsehpreis ausgezeichnet. Seit Ende der neunziger Jahre arbeitet Eichhorn verstärkt auch fürs Kino: So war sie in dem umstrittenen Gerichts- und Geschichtsdrama "Nichts als die Wahrheit" (1999) sowie dem Psychodrama "Fremde Freundin" (1998) zu sehen. 2002 sorgte sie in Dominik Grafs poetischem Melodram "Der Felsen" für Aufsehen: Ihre Darstellung einer Frau, die sich während eines Korsika-Urlaubs auf eine folgenreiche Affäre mit einem jugendlichen Delinquenten einlässt, brachte ihr einen Bayerischen Filmpreis sowie eine Nominierung zum Deutschen Filmpreis ein. Kritikerlob erntete Eichhorn, die bekannt dafür ist, mit ihren Leistungen nur selten zufrieden zu sein, auch für ihre Rolle in Thomas Arslans poetischem "Ferien" und Bernd Böhlichs Sommerkomödie "Du bist nicht allein".

In den Jahren danach wirkte sie in einer Reihe von Fernsehproduktionen mit. So etwa in Oliver Storz' zur Zeit des Wirtschaftswunders angesiedeltem Drama "Die Frau, die im Wald verschwand" (2009) oder in einer Hauptrolle der satirischen Comedy-Serie "Der kleine Mann" (2009). Auf der Kinoleinwand stellte Eichhorn in sehr unterschiedlichen Filmen ihre Vielseitigkeit unter Beweis. Sie hatte eine Nebenrolle in der Klamauk-Komödie "Ossi's Eleven" (2008) und gab in der schwarzen Komödie "Die Eisbombe" (2008) die Mutter einer hoffnungslos neurotischen Familie. In der Bestseller-Verfilmung "Das letzte Schweigen" (2010) beeindruckte sie als Kleinstadtmutter, deren Tochter ermordet wird, in Thomas Arslans Gangsterfilm "Im Schatten" (2010) als Anwältin eines frisch aus dem Gefängnis entlassenen Schwerverbrechers.

Eine gänzlich andere Rolle hatte sie dann in der Komödie "Die Kirche bleibt im Dorf" von Ulrike Grote, der 2012 in die Kinos kam: Darin spielte Eichhorn eine schwäbische Dorfbewohnerin, die in einen skurrilen Kleinkrieg zwischen ihren Mitbürgern und den Einwohnern eines verfeindeten Dorfes hineingezogen wird.