Sebastian Rudolph wurde 1968 in Berlin als Sohn der Schauspielerin Hildegard Schmahl und des Regisseurs Niels-Peter Rudolph geboren. Von 1989 bis 1990 absolvierte er eine Ausbildung am Schauspielstudio Frese in Hamburg. In den folgenden Jahren hatte er zahlreiche Engagements an verschiedenen Bühnen, darunter das Theater Basel, das Berliner Ensemble, die Schaubühne Berlin, das Deutsche Theater Berlin, die Volksbühne Berlin, das Schauspielhaus Hamburg und das Wiener Burgtheater. Die Bandbreite seiner Bühnenauftritte reichte von "Leonce und Lena" über "Drei Schwestern" und "Heinrich IV" bis zu "Die Nacht singt ihre Lieder". Dabei arbeitete er mit namhaften Regisseuren wie Christoph Marthaler, Luc Bondy, Robert Wilson, Christoph Schlingensief und Schorsch Kamerun zusammen.

Parallel zu seiner umfangreichen Bühnenarbeit wirkte Rudolph von Beginn seiner Karriere an auch in Kino- und Fernsehproduktionen mit. Seine erste Filmrolle war gleich eine Hauptrolle: In Peter Timms Komödie "Manta – Der Film" (1991) spielte er einen 17-jährigen Fahrschüler, der vom Golf-Fan zum Manta-Fahrer wird. Anschließend gehörte er zur Hauptbesetzung von Joseph Vilsmaiers Kriegsdrama "Stalingrad" (1992). Abgesehen von einem kleinen Auftritt als Offizier in "The English Patient" ("Der englische Patient", US/GB 1996) sah man ihn danach für viele Jahre fast ausschließlich in Fernsehparts.

Rudolph hatte tragende Fernsehrollen zum Beispiel in der Schwul-Hetero-Liebeskomödie "Coming In" (1997) mit Franka Potente, und in Bernd Schadewalds Junkie-Drama "Der Pirat" (1998) mit Jürgen Vogel. In der Komödie "Der Millionär und die Stripperin" (2001) gab er den Sohn eines reichen, verliebten Geschäftsmanns; Markus Imboden besetzte ihn in dem Krimi "Mörderische Erpressung" (2006) als Mordverdächtigen aus bestem Hause. In der Filmbiografie "Remarque - Sein Weg zum Ruhm" (2008) verkörperte Rudolph den Schriftsteller Axel Eggebrecht. Häufig übernahm er auch Gastrollen in Fernsehserien wie "Tatort", "Wolffs Revier", "Alphateam - Die Lebensretter im OP" und "Doppelter Einsatz".

Zur Spielzeit 2009/2010 wurde Sebastian Rudolph festes Ensemblemitglied des Hamburger Thalia Theaters. Für seine viel gerühmte Darstellung in "Faust I+II" kürten ihn die Kritiker der Fachzeitschrift Theater heute zum Schauspieler des Jahres 2012.

Trotz seiner Bühnenverpflichtungen blieb Rudolph vor der Kamera aktiv. So etwa für Markus Imbodens "Tod einer Brieftaube" (2012, TV) als Entführungsopfer aus reichem Hause. Eine wichtige Rolle hatte er auch in Roland Suso Richters "Die Spiegel-Affäre" (2014, TV), wo er den "Spiegel"-Herausgeber Rudolf Augstein verkörperte; Sherry Hormann besetzte ihn in dem Polit-Verschwörungsthriller "Tödliche Geheimnisse" (2016) in einer Nebenrolle als idealistischen Redakteur.

Kleinere Kinorollen übernahm Rudolph als Vater in dem Jugenddrama "4 Könige" (2015) und als Arzt in dem Beziehungsdrama "Gleißendes Glück" (2016). Eine Kino-Hauptrolle spielte er in dem preisgekrönten "Whatever Happens Next" (DE/PL 2018), als Familienvater, der seine bürgerliche Existenz aufgibt und fortan als freundlicher Taugenichts, Schnorrer und Hochstapler durchs Land zieht.

Danach sah man ihn in einer Nebenrolle in Florian Henckel von Donnersmarcks Künstlerbiografie "Werk ohne Autor" (2018) und als sensiblen Neurologen in Katrin Gebbes preisgekröntem Mystery-Horror "Pelikanblut" (2019). Eine Hauptrolle spielte er in Ulrich Köhlers und Henner Wincklers "Das freiwillige Jahr" (2019), über eine Abiturientin (Maj-Britt Klenke) in der deutschen Provinz, die sich von den Zukunftsplänen ihres alleinerziehenden Vaters (Rudolph) emanzipieren will. Für diese Rolle wurde er für den Preis der deutschen Filmkritik nominiert. Ebenfalls als Vater der weiblichen Hauptfigur war er in Maggie Perens romantischer Komödie "Hello Again - Ein Tag für immer" (2020) zu sehen.  

Im Fernsehen übernahm Rudolph unter anderem (Neben-)Rollen in der Siegfried-Lenz-Verfilmung "Deutschstunde" (2019), der Familiensaga "Altes Land" (2020) und einer Folge der Reihe "Der Zürich-Krimi" (2021) mit Christian Kohlund. In der Streaming-Serie "Wir Kinder vom Bahnhof Zoo" (2021) verkörperte er einen masochistischen Freier.  

Eine weitere Kinohauptrolle spielte Sebastian Rudolph in dem preisgekrönten Drama "Piaffe" (2022), als Botaniker, der eine SM-Affäre mit einer Geräuschemacherin beginnt, der bei der Vertonung eines Pferdes ein Schweif aus dem Steißbein wächst.