Gabriele M. Walther studierte bis 1985 an der Hochschule für Fernsehen und Film München (HFF). Ursprünglich für den Bereich Dokumentation angenommen, arbeitete sie bald mit Studierenden des Spielfilms zusammen, darunter vor allem mit Roland Emmerich. Dessen Abschlussfilm "Das Arche Noah Prinzip" (1984) war der teuerste Film in der Geschichte der HFF, was zu Konflikten mit der Hochschule führte. Diese machte Walther als Produzentin für die Überziehungen verantwortlich, sodass sie die HFF und in der Folge auch den Freistaat Bayern verklagte. Das Verfahren gewann sie in einem Vergleich, fand jedoch beruflich keinen Anschluss und machte sich daher zunächst mit einer Agentur selbstständig.

1984 gründete Walther zusammen mit Ulrich Edel die Ulrich Edel Film Produktion. Im Zuge einer Dokumentation über Grandhotels für das ZDF folgte 1986 die Gründung der Caligari Film- und Fernsehproduktions GmbH, bei der sie die Position der Geschäftsführerin und Gesellschafterin übernahm.

Durch den RTL-Geschäftsführer Helmut Thoma wandte sich Walther dem Sitcom-Format zu, machte eine Ausbildung in den USA und produzierte 1993 "Hilfe, meine Familie spinnt!" als deutsche Adaption der Sitcom "Married... with Children". Daraufhin brachte Bernd Eichinger Walther und Tom Gerhardt für die Arbeit an der TV-Serie "Hausmeister Krause – Ordnung muss sein" zusammen, die sie ab 1999 produzierte.

Daneben verantwortete Walther 2004 die Dokumentation "Kanalschwimmer" über eine schwimmende Durchquerung des Ärmelkanals, für die der Regisseur Jörg Adolph einen Deutschen Fernsehpreis erhielt.

Auf der Kinoleinwand feierte Walther mit ihrer Caligari Film seit Beginn der 2000er-Jahre im Segment Animation große Erfolge. Sie realisierte Animationsproduktionen wie "Felix - Ein Hase auf Weltreise" (2005), "Der Mondbär - Das große Kinoabenteuer" (2008), "Prinzessin Lillifee" (ab 2009), "Ritter Rost" (ab 2012), "Der kleine Drache Kokosnuss" (ab 2014), und "Käpt'n Sharky" (2017) – für die sie mehrfach mit dem Kinder-Medienpreis Der weiße Elefant ausgezeichnet wurde.

Darüber hinaus produzierte Walther den postapokalyptischen Thriller "Hell" (2011) von Tim Fehlbaum. Anschließend entstanden neben Animationsfilmen erneut Produktionen für Fernsehen und Streaming wie "The Drag and Us" (2020), "Mich hat keiner gefragt" (2020) und "Mandy und die Mächte des Bösen" (2023).

Gabriele M. Walther setzte sich schon früh für die Förderung von Frauen in der Film- und Fernsehbranche ein und rief 2018 das Mediva-Netzwerktreffen ins Leben. Zudem initiierte sie eine Produzentinnenstudie, um auf strukturelle Benachteiligungen von Produzentinnen aufmerksam zu machen.

2025 erhielt Gabriele M. Walther den Carl Laemmle Produzentenpreis "für ihre außergewöhnliche Vielseitigkeit, ihren unternehmerischen Mut und ihren prägenden Beitrag zum deutschen Animationsfilm". Frühere Preisträger waren unter anderem Roland Emmerich, Regina Ziegler und Stefan Arndt.