Markus John wurde am 17. Februar 1962 in Duisburg geboren. 1981 begann er eine Ausbildung an der Münchner Schauspielschule Zinner-Studio und war nach seinen Abschluss 1984 an einer Reihe hochkarätiger Theaterhäuser engagiert, darunter das Bayerische Staatsschauspiel in München, das Stadttheater Bern, das Hamburger Thalia Theater, der Berliner Ensemble und das Deutsche Theater Berlin. 1997 wurde er ins Ensemble des Schauspiel Köln berufen.  

Neben der umfangreichen Bühnenarbeit begann John Ende der 1990er-Jahre, gelegentlich in Fernsehproduktionen mitzuwirken. Meist übernahm er kleinere Nebenrollen in Krimireihen wie "Balko" "Tatort", "Die Kumpel" und "Die Wache".  Auf der Kinoleinwand sah man ihn in kleinen Parts der Charakterstudie "Narren" (2003) und Sherry Hormanns Komödie "Männer wie wir" (2004), in dem er zum Team einer schwulen Fußballmannschaft gehörte.  

Zur Spielzeit 2009/2010 wechselte John von Berlin ins Ensemble des Deutschen Schauspielhauses Hamburg. Für seine Titelrolle in "Ödipus" wurde er dort 2013 mit dem Rolf-Mares-Preis ausgezeichnet. Als Kurator, Regisseur und Darsteller realisierte er 2012 "Foxi, Jussuf, Edeltraud", ein Ein-Personen-Programm, bei dem das gesamte Textmaterial auf Interviews basiert, die John mit Menschen führte, die er zufällig ausgewählt und vorher nicht gekannt hat. In der Spielzeit 2014/15 gastierte er in einer Inszenierung von Schillers "Maria Stuart" am Schauspiel Hannover.  

Ab den 2010er-Jahren wurden Johns TV-Rollen größer. Er spielte den Vater eines Mordopfers in der Dortmunder "Tatort"-Folge "Eine andere Welt" (2013) und einen rückfälligen Sexualstraftäter in der Rostocker "Polizeiruf 110"-Folge "Angst heiligt die Mittel" (2016). In der sechsteiligen Sitcom "Ellerbeck" (2015) hatte er eine Hauptrolle als Stadtrat einer fiktiven Kleinstadt im Emsland. Im Kino gehörte er zum Ensemble von Sönke Wortmanns Frank-Goosen-Verfilmung "Sommerfest" (2017).  

2019 stand John in der Hauptrolle eines Familienvaters für das Kleinstadt-Sozialdrama "Eher fliegen hier Ufos" (TV) vor der Kamera, das jedoch erst Ende 2023 ausgestrahlt wurde – und John einen Deutschen Schauspielpreis einbrachte. Eine feste Serienhauptrolle übernahm er ab 2022 als Kommissar in "WaPo Duisburg".  

Johns Hauptbetätigungsfeld blieb gleichwohl das Theater. 2023 wurde er am Kölner Theater im Bauturm, wo er regelmäßig mit dem Programm "Foxi, Jussuf, Edeltraud" auftrat, mit dem Bauturm Kunstpreis ausgezeichnet.  

Seine erste Kino-Hauptrolle spielte er in der Tragikomödie "Seid einfach, wie ihr seid" (2022), als Vater einer Filmhochschülerin, die ihren Abschlussfilm über das Wiedersehen ihrer schon lange getrennten Eltern drehen will. "Seid einfach, wie ihr seid" feierte im Januar 2023 beim Filmfestival Max Ophüls Preis Premiere und startete im Herbst 2025 regulär in den Kinos.