Josefine Preuß wurde am 13. Januar 1986 im brandenburgischen Zehdenick geboren. Schon in jungen Jahren trat sie bei Theateraufführungen in Potsdam auf. Die Kinderserie "Schloss Einstein" (2000-2003), die im Fernsehsender Ki.Ka ausgestrahlt wird, machte sie mit ihrer Rolle als intrigante Anna Reichenbach erstmals einem breiteren Publikum bekannt. Preuß besuchte die Schauspielschule "Die Etage" in Berlin, beendete ihr Studium allerdings nicht.

Ihre Kinokarriere startete 2003 mit der Rolle der Emilia in dem Jugenddrama "Jargo" an der Seite von Constantin von Jascheroff und Nora von Waldstätten. Seither war sie in  zahlreichen Fernseh- und Kinofilmen zu sehen, so etwa 2005 in "Afterhour" von Irma-Kinga Stelmach oder unter der Regie von Felicitas Darschin in der Märchenadaption "Zwerg Nase" (2007).

Die Rolle der frechen Lena, die sie von 2005 bis 2008 in der ARD-Erfolgsserie "Türkisch für  Anfänger" spielte, verhalf Preuß zu einem ersten großen Durchbruch. 2007 wurde sie für ihre Leistung für den Deutschen Comedypreis nominiert, im Jahr darauf erhielt sie stellvertretend für das Darstellerensemble einen Grimme-Preis.

Außerdem spielte sie in der Ludwigshafener "Tatort"-Folge "Vermisst" (2008) und dem 2010 ausgestrahlten Berliner "Tatort" "Die Unmöglichkeit, sich den Tod vorzustellen". In der Komödie "RubbeldieKatz" (2011) von Detlev Buck übernahm sie die Nebenrolle der Benita.

2011 schlüpfte Preuß für "Türkisch für Anfänger", den Kinofilm zur gleichnamigen Serie, erneut in die Rolle der Lena. Die Komödie startete im März 2012 in den deutschen Kinos.